• Apparition en 1970: B Hesper et P Hogeweg, « Bioinformatica: een werkconcept », Kameleon, vol. 1, no 6, 1970, p. 28–29

La bio-informatique est constituée par l’ensemble des concepts et des techniques nécessaires à l’interprétation informatique de l’information biologique. Plusieurs champs d’application ou sous-disciplines de la bio-informatique se sont constitués (Wikipedia):

• La bio-informatique des séquences
• La bio-informatique structurale
• La bio informatique des réseaux
• La bio-informatique statistique et des populations

• Idée lancée en 1985 par 3 scientifiques, Renatto Dulbecco, Robert Sinsheimer (directeur de UCSC) et Charles DeLisi, qui financera le projet (Directeur dept. de biologie du Département de l’Energie US)
• Séquençage lancé en 1988 par le National Research Council. En suisse est créé HUGO (Human Genome Organisation) pour la coordination.
• En 1998, Craig Venter, crée Celera Genomics avec pour objectif le séquençage en 3 ans par séquençage Shotgun et le brevetage du génome (!).
• En 2000, la complétion du séquençage est annoncé pour le Consortium et Celera Genomics (match nul) par le président B. Clinton. Coût: $3B.
• Celera Genomics avouera avoir utilisé les données du Consortium pour son propre assemblage, mais reproduira un séquençage de Novo 3 ans plus tard…
• Publication des séquences brutes en 2001 et des séquences finales en 2004.

https://planet-vie.ens.fr/thematiques/manipulations-en-laboratoire/la-revolution-de-la-genomique-les-nouvelles-methodes-de

• Séquençage Sanger: faible débit, utilisée pour le séquençage du génome humain

• Séquençage de nouvelle génération: adapté au séquençage massif d’un grand nombre de génome pour étudier les variations génétiques (GWAS). Le leader du marché aujourd’hui est Illumina.

Le principe d’un séquençage NGS consiste à:

• Créer une librairie de fragments d’ADN (par fragmentation enzymatique et mécanique de l’ADN génomique).
• Relier ces fragments à des adaptateurs, des petites molécules d’ADN de séquences connues nécessaires au séquençeur.
• Une sélection de la taille minimum et maximum des fragments est effectuée pour des raisons techniques, notamment l’amplification PCR.
• Faire une amplification PCR des fragments.
• Faire le séquençage.

Applications principales

• En Recherche: Recherche de mutations dans des panels larges ou des exomes complet) à visée de découverte.

• En Clinique: Recherche de mutations dans des panels restreints pour le diagnostique.

• Permet l’étude de mutations en génétique constitutionnelles et somatiques à faible pourcentages.

• Grâce au NGS, un grand nombre de patients peuvent être analysés simultanément et rapidement.

• L’analyse bioinformatique devient partie intégrante du processus de traitement.

• Explosion de la quantité de données générée
  • Volume massif : Le séquençage à haut débit génère des téraoctets de données brutes, nécessitant des infrastructures de stockage et de gestion adaptées (Cluster de calcul - Exemple: IFB, Cloud de stockage).
  • Coût du stockage et du calcul : Le traitement et l’analyse des données nécessitent des ressources informatiques puissantes qui on un coût.
  • Archivage et accessibilité : Les plateformes comme ENA, SRA et EGA doivent assurer une conservation sécurisée des données sur le long terme.
• Complexité des approches analytiques
  • Prétraitement des données : Alignement des lectures (BWA, Bowtie2), suppression des erreurs de séquençage, normalisation des données d’expression, etc.
  • Analyse de variants : Identification des SNPs, indels et mutations structurales à partir des reads bruts, avec des outils comme GATK ou DeepVariant.
  • Annotation des variants : L’association entre variations génétiques et pathologies reste un défi, nécessitant des bases de données fonctionnelles et cliniques (gnomAD, OMIM) (Outil VEP: Variant Effect Predictor: ).

• Le COFRAC (Comité Français d’Accréditation) est l’unique instance en France chargée de délivrer les accréditations selon les normes internationales.
• En biologie médicale, l’accréditation COFRAC est obligatoire pour les laboratoires réalisant des examens de diagnostic.
• Elle garantit la conformité aux bonnes pratiques, la traçabilité, et le contrôle qualité des analyses.
• Elle est souvent fondée sur la norme NF EN ISO 15189.
• Le processus d’accréditation comprend des audits réguliers et une déclaration de portée.

• La norme NF EN ISO 15189 définit les exigences en termes de qualité et de compétence technique pour les laboratoires de biologie médicale.
• Elle couvre :
  • Le management de la qualité (documentation, revue de direction, audits internes)
    
  • Les exigences techniques (personnel, équipements, méthodes, validation)
    
  • La traçabilité des résultats, gestion des échantillons et des données.
• Elle place l’amélioration continue au cœur du processus qualité.
• L’accréditation selon cette norme est indispensable pour prouver la fiabilité et la reproductibilité des analyses.

• La norme ISO/IEC 27001 s’applique à la gestion de la sécurité de l’information.
• Elle définit les exigences pour mettre en œuvre un SMSI (Système de Management de la Sécurité de l’Information).
• Objectif : garantir la confidentialité, intégrité et disponibilité des données (par exemple, données patients, résultats NGS).
• Impliquée dans la protection des systèmes informatiques, des accès, des sauvegardes et des risques.
• De plus en plus importante en bioinformatique et pour les infrastructures manipulant des données de santé sensibles.

• Diagnostic des maladies génétiques
  • Exome sequencing (WES, Whole Exome Sequencing) : Permet d’identifier des mutations dans les régions codantes du génome associées à des maladies rares (ex. : mucoviscidose, dystrophie musculaire, syndrome de Marfan).
  • Génome entier (WGS, Whole Genome Sequencing) : Détecte des variants structurels complexes, tels que des délétions ou duplications impliquées dans des pathologies comme les syndromes de déficience intellectuelle.
• Oncogénomique et médecine personnalisée
  • Panel de gènes ciblés : Analyse de gènes spécifiques liés au cancer (ex. : BRCA1/2 pour le cancer du sein et de l’ovaire, EGFR pour le cancer du poumon).
  • RNA-seq en oncologie : Détecte des altérations de l’expression génique et identifie des translocations fusionnelles (ex. : BCR-ABL dans la leucémie myéloïde chronique).
  • Suivi des tumeurs et biopsie liquide : Détection de l’ADN tumoral circulant (ctDNA) pour surveiller l’évolution des cancers et la résistance aux traitements.
• Immunogénomique et médecine de transplantation
  • Typage HLA par NGS : Analyse des gènes du complexe majeur d’histocompatibilité (HLA) pour optimiser la compatibilité entre donneur et receveur lors des greffes d’organes et de moelle osseuse.
  • Répertoire des récepteurs T et B (TCR/BCR-seq) : Analyse de la diversité des lymphocytes pour évaluer la réponse immunitaire et diagnostiquer des maladies auto-immunes ou hématologiques.

• Hybridation d’un brin sur un oligonucléotide attaché à la FlowCell

• Un brin complémentaire est synthétisé.

• La molécule d’origine est enlevée et la molécule libre s’hybride en pont.

• Un brin supplémentaire est synthétisé de nouveau.

• Les brins complémentaires à la cellule d’origine sont lavés et il ne reste que plusieurs copies d’une même brun (clusters)

• Il reste à séquencer les brins présents: Lors de cette étape, le nucléotide incorporé est identifié grâce à un groupe fluorescent identifié par laser, permettant d’enregistrer la séquence de manière informatique.

• https://www.youtube.com/watch?v=CZeN-IgjYCo

• https://www.youtube.com/watch?v=WneZp3fSJIk

Figure B: Schéma représentant les clusters sur une FlowCell

Figure C: Réaction de séquençage

Il est possible de créer une librairie enrichie en régions d’intérêt, par exemple pour séquencer uniquement les régions codantes du génome:

• Par capture: Il est possible de concevoir des sondes qui vont s’attacher à l’ADN d’intérêt, elle même étant liées à des molécules de biotines attachées à des billes magnétiques, qui sont conservées après lavage.
• par amplicon: Il est possible de faire une amplification sélectionnée par des amorces PCR choisies.

La préparation des librairies est une étape critique qui influence directement la qualité et la fiabilité des résultats du séquençage. Plusieurs paramètres doivent être considérés :

1. Type d’échantillon et application
   • ADN génomique (gDNA) : Utilisé pour le séquençage du génome entier, des exomes ou des panels ciblés.
   • ARN (RNA-seq) : Essentiel pour l’analyse de l’expression génique et l’identification de fusions oncogéniques.
   • ADN dégradé (FFPE, biopsies liquides) : Nécessite des protocoles adaptés pour limiter les biais d’amplification.
2. Stratégies d’enrichissement
   • Séquençage ciblé (capture hybride, amplicons) : Améliore la profondeur de lecture sur des gènes spécifiques, idéal pour le diagnostic clinique. -RNA-seq polyA vs. rRNA depletion : Le choix entre ces méthodes dépend de l’intérêt pour l’ARN codant (mRNA-seq) ou l’ensemble du transcriptome (total RNA-seq).

Il est avantageux d’obtenir des fragments de lecture les plus longs possible pour un alignement le plus fiable possible.

• Lors d’un séquençage simple (Single-end), les brins sont séquencés en partant d’un unique adaptateur. Un read correspond donc ensuite à un fragment.

• Lors d’un séquençage appairé (Paired-end), les brins sons séquencés à partir de leur deux extrémités. Les fragment résultats sont appelés R1 et R2 et sont liés, qu’ils soient recouvrant ou pas.

Un site expliquant cela de manière intéressante:

http://thegenomefactory.blogspot.com/2013/08/paired-end-read-confusion-library.html

• Contrôle Qualité sur les données brutes suivi éventuellement d’un Trimming
• Alignement des reads sur le génome de référence
• Appel de variants
• Annotation et production d’un fichier VCF et d’un compte-rendu

Ils contiennent les reads: petite séquence d’un fragment d’ADN de longueurs plus ou moins fixe.

• Single-end
  • Chaque read est indépendant
• Paired-end
  • Le séquençage est fait par chaque extrémité de chaque brin. Dans ce cas, les reads sont organisés par paires

@HWI-ST865:166:D0C4KACXX:2:1101:1042:1954 1:Y:0:
CNANAAATNAANNNNGNNNNNNNNNANNNNNAAANNNTNNNNNNNNNTNNTGNNNNTTGTTTNNTTGTGGGTTTCTCTGTCCCCN
+
#####################################################################################
@HWI-ST865:166:D0C4KACXX:2:1101:1241:1970 1:N:0:
CCAGCGACACTTGCAGCTTAGGGGCAAGAGGCTCCCACAACACCCTGTGCGATCGGAAGAGCGGTTCAGCAGGGATGCCGCGGCC
+
GFFIGIIIFGEHHIJJJIIGGGHIIBD=BFG?EDECC@FGCHC?BCCBB)53(;;B;?8299?######################

Quelques définitions:

• Valeur de qualité exprimée en \(QPhred\)
• \(QPhred\) = probabilité \(p\) d’erreur de mauvaise identification de la base
• \(QPhred = -10.log_{10}(p)\)

Exemple:

• Q20 correspond à une probabilité d’erreur de 1%
• Q30 correspond à une probabilité d’erreur de 0,1%

Le trimming (“rognage”) est une étape préliminaire mais cruciale qui consiste à nettoyer les lectures (reads) pour améliorer la qualité globale des données en supprimant :

1. Les adaptateurs :

   → Séquences artificielles ajoutées pendant la préparation des librairies.

   → Peuvent apparaître à l’extrémité des reads si la lecture dépasse l’insert.

2. Les bases de mauvaise qualité :

   →La qualité de séquençage chute souvent sur la début ou la fin des reads.

   → On retire les bases dont le score de qualité est trop faible (Phred < 20 ou 30).

3. Les séquences trop courtes ou ambigües :

   → Les reads très courts (après trimming) ou contenant trop de N sont parfois éliminés.

Il existe plusieurs programmes tels que Trimomatic, Cutadapt, fastp.

But: Aligner les séquences présentes dans les fichiers FASTQ sur le génome de référence (Fichier fa).

• Étapes principales :
  1. Indexation du génome → Construction d’une structure de données pour l’alignement rapide.
  2. Alignement des reads → Chaque read est comparé à l’index pour trouver sa position optimale.
  3. Gestion des erreurs → Les logiciels tolèrent des mismatches, insertions ou délétions.

Logiciels courants : - BWA et sa variant BWA-mem (pour l’ADN) - STAR (pour l’ARN)

Ces logiciels vont produire un fichier BAM: contient les positions, qualités, erreurs, etc.

Référence: Li et al: Fast and accurate short read alignment with Burrows–Wheeler transform. Bioinformatics. 2009 Jul 15; 25(14): 1754–1760.

BWA (Burrows-Wheeler Alignment tool)a été spécialement conçu pour l’alignement de millions de séquences peu divergentes d’un génome de référence.

Il est basé sur la Transformée Burrows-Wheeler associé à un algorithme de tri par arbre. Il permet l’alignement de reads relativement longs pour lesquels il existe des seuils (gap) en cas de présence d’INDELS.

Il utilise une quantité relativement faible de mémoire (bwa-mem) et est parallélisable, pour exploiter les architectures multi-coeurs.

La détection des variants (variant calling) consiste à identifier les différences entre la séquence d’ADN séquencée (reads dans le fichier BAM) et une séquence de référence. Cette analyse permet de détecter des mutations telles que des substitutions, des insertions, des délétions et des variations structurelles.

• SNP: Single Nucleotide Polymorphisms: Changement d’un simple nucléotide

• InDEL: Insertion-DELetion: Insertion ou délétion d’une séquence jusqu’à 50 nucléoïdes.

• CNV: Copy Number variation: Variant Structurel de plus de 1kB (Autre algorithme de détection)

• Définition : Un SNP est une variation de simple nucléotide dans une séquence d’ADN. Cela signifie qu’un seul nucléotide (A, T, C ou G) est remplacé par un autre.

• Fréquence : Les SNPs sont très courants dans le génome humain et représentent la variation génétique la plus répandue.

• Exemple : Si dans une séquence d’ADN on a un “A” à un endroit donné chez une personne, un autre individu peut avoir un “G” à ce même endroit.

• Effet : Les SNPs peuvent être neutres (n’ayant aucun effet), ou bien influencer l’expression des gènes, la fonction des protéines, ou la susceptibilité aux maladies. Certains SNPs sont également utilisés comme marqueurs génétiques pour étudier l’héritabilité de traits et de maladies.

• Définition : Un InDEL est une variation où une ou plusieurs paires de bases d’ADN sont soit insérées (ajoutées) soit supprimées (délétion) dans une séquence d’ADN. Les InDELs peuvent être de petite taille (1-50 paires de bases) ou plus grandes.

• Exemple : Si une séquence originale est ATGCGT, une insertion pourrait donner ATGCCGT, et une délétion pourrait donner ATGT.

• Effet : Les InDELs peuvent provoquer un décalage du cadre de lecture (frameshift), surtout dans les gènes codants, ce qui peut aboutir à des protéines non fonctionnelles. Cela peut être lié à des maladies génétiques ou des traits spécifiques.

• Définition : Un CNV est une variation où des grandes portions de l’ADN (plus de 1 kb) sont présentes en copies supplémentaires ou manquantes par rapport au génome de référence. Cela implique une duplication ou une délétion de segments d’ADN, souvent beaucoup plus grands que les Indels.

• Exemple : Une personne peut avoir trois copies d’une région spécifique d’un chromosome, alors que la plupart des gens en ont deux (une copie de chaque parent).

• Effet : Les CNVs peuvent affecter plusieurs gènes et ont un impact majeur sur l’expression des gènes, car ils augmentent ou diminuent la quantité d’ADN codant disponible. Ils sont associés à divers troubles génétiques, comme le syndrome de Down (duplication d’un segment sur le chromosome 21), et à d’autres traits et maladies complexes.

• Détection: ils sont détectes par des algorithmes plus complexes que les SNPs et InDELs.

Lors du séquençage, chaque position du génome est couverte par plusieurs reads. Pour chaque position, le variant caller compare les bases nucléotidiques observées aux bases attendues dans la séquence de référence et calcule la fréquence des allèles alternatifs.

But: recherche de mutations dans des gènes d’interêt sur un échantillon.

Etapes de l’analyse bioinformatique:

• Contrôle Qualité sur les données brutes (Obligatoire!)
• Alignement des reads sur le génome de référence
• Appel de variants (Recherche des SNP et INDELS)
• Annotation et production d’un fichier VCF et d’un compte-rendu
• \(VAF= Variant AlleleFrequency = \frac{N (Reads Mutés)}{Profondeur}\)

Référence: Daniel C. Koboldt et al: VarScan: variant detection in massively parallel sequencing of individual and pooled samples: Bioinformatics. 2009 Sep 1; 25(17): 2283–2285.

Varscan est un programme de détection de variants utilisable aussi bien en constitutionnel qu’en tumoral. Il permet également de travailler de manière individuelle (un échantillon à la fois) ou sur plusieurs échantillons par le biais d’un VCF multi-échantillons.

Site Web: https://dkoboldt.github.io/varscan/germline-calling.html

Le format de fichier VCF (Variant Call Format) est typiquement utilisé pour l’échange de données. (Nous en sommes à le version 4.3) (https://samtools.github.io/hts-specs/VCFv4.3.pdf).

Ca format a été développé dans le cadre de large projets génomiques (1000 Genome Project). Certain sites ont développé leur propre spécification du format VCF.

• Une en-tête (marquée avec des ##) contenant les métadonnées:

  • Génome
  • Logiciel utilisé pour l’appel de variants
  • Définition de plusieurs variables qualité (DP, Génotype)
  • Définitions des entrées FILTER, INFO et FORMAT

• (Optionnel) La liste des régions du génome analysé (Format gVCF)

• La liste des variants contenant:

  • Chromosome
  • Coordonnées chromosomiques
  • ID, REF=allèle de référence, ALT=allèle mutant
  • QUAL= qualité du variant), FILTER (PASS ou FAILED)
  • INFO= Informations définies dans l’en-tête
  • FORMAT= Information génomiques

• Entrées FILTER: Descripton du filtre utilisé pour le contrôle qualité

• Entrées INFO: Informations sur l’ensemble des échantillons

• Entrées FORMAT: Informations spécifique à chaque échantillon

C’est un fichier texte délimité par des tabulations. On peut donc l’ouvrir avec M$ Excel mais en général, nous travaillons sur ce type de fichiers avec des outils dédiés ou des scripts “maison” du fait de leur volume.

Voici quelques outils très intéressants pour la manipulation de fichiers VCF:

• VCFTools (https://vcftools.github.io/index.html)
• BCFTools
• VT…

Il existe également un format étendu genomic VCF (gVCF), utilisé avec GATK, qui contient des informations sur les blocs qui correspondent à le référence et à leur qualité.

GENCODE est un projet international visant à fournir une annotation complète et précise des éléments génomiques du génome humain (hg19/GRCh37, GRCh38) et de la souris (mm10/GRCm38, GRCm39): https://www.gencodegenes.org/

• La liste complète des gènes (protéiques et non codants)
• Les transcrits alternatifs
• Les pseudogènes
• Les exons, introns, UTRs, start/stop codons
• Les fichiers GTF/GFF utilisés dans les pipelines bioinformatiques

A quoi ca sert ?

• Annotation des variants (ex: VEP ou ANNOVAR utilisent GENCODE)
• Analyse d’expression (ex: RNA-seq)
• Études des transcrits non codants
• Support aux projets de génomique fonctionnelle

RefSeq (Reference Sequence) est une base de données de séquences de référence maintenue par le NCBI (National Center for Biotechnology Information). Elle fournit des séquences normalisées et validées pour :

• ADN génomique
• ARN (messager, non codant)
• Protéines

Objectif:

• Offrir une référence stable pour la recherche, le diagnostic et les analyses bioinformatiques.
• Uniformiser les annotations et limiter la redondance (une seule séquence de référence par gène).
• Permettre la comparaison entre individus ou espèces via des séquences bien définies.

Accès RefSeq: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/ Accès GENCODE: https://www.gencodegenes.org/

Les deux ressources sont complémentaires :

• RefSeq est souvent utilisé en diagnostic pour sa fiabilité.
• GENCODE est souvent préféré en recherche fondamentale pour sa richesse.

La nomenclature HGVS (Human Genome Variation Society) est - un système standardisé - permettant de décrire les variations génétiques de manière précise et univoque.

• Standardisation : Permet une communication claire entre chercheurs et cliniciens.

• Interprétabilité : Utilisée dans les bases de données cliniques (ClinVar, dbSNP, LOVD).

• Reproductibilité : Facilite l’intégration des variants dans les outils bioinformatiques.

• HGVS official guidelines : https://varnomen.hgvs.org

• Mutalyzer (outil pour vérifier les annotations) : https://mutalyzer.nl

La nomenclature HGVS décrit les variations en fonction de la séquence de référence utilisée (ADN, ARN ou protéine)

Elle suit la structure générale suivante :

[Type de séquence] [Identifiant de la séquence de référence] : [Type de variation]

Les principaux types de séquences utilisées sont : - g. → génomique (ex. : NC_000023.11:g.32389689G>A) - c. → cDNA (ex. : NM_004006.2:c.35delG) - r. → ARN (ex. : NM_004006.2:r.35_36del) - p. → protéine (ex. : NP_003997.1:p.Gly12Val)

L’annotation des variants consiste à collecter de l’information sur l’impact du variant:

• Dans quel gène/exon se trouve la mutation et quel est son impact au regard de la protéine correspondante ?

• Détermination de leur fréquence dans les populations, que ce soit parmi la population générale ou parmi des patients atteins de cancers ou maladies rares.

• Conséquences fonctionnelles (Mutation sans effet (synonyme), Mutation faux-sens (missense), Mutation non-sens (stop-gain, stop-loss), Mutation sur site d’épissage, variant intronique (UTR) )

• Interpretation clinique (classification pathogène, vraisamblablement pathogène, VUS (Variant of Unknown Significance), Bénin)

L’impact peut être plus ou moins important suivant la localisation du variant:

• Région codante, Sites d’épissage (jonctions exon-intron), Régions régulatrices (promoteur, UTRs, enhancers), Introns ou régions intergéniques

Région codante (exon)

• Synonyme (silent) : Pas de changement d’acide aminé → souvent neutre.
• Missense (non synonyme) : Changement d’un acide aminé → impact variable.
• Nonsense (stop) : Création d’un codon stop → protéine tronquée.
• Frameshift : Décalage du cadre de lecture → séquence totalement modifiée.

Sites d’épissage (jonctions exon-intron)

• Modification de l’épissage → perte ou ajout d’exons/introns.
• Peut causer des protéines aberrantes.
• ⚠️ Détection par des scores comme SpliceAI, MaxEntScan.

Régions régulatrices (promoteur, UTRs, enhancers)

• Influence l’expression du gène.
• Peut affecter la stabilité ou la traduction des ARNm.
• Impact plus difficile à prédire, outils : RegulomeDB, FunSeq2.

Introns ou régions intergéniques

• Souvent neutres.

• Risque : création de nouveaux sites d’épissage ou modification d’éléments régulateurs.

• Filtrage des variants : on priorise les exoniques non synonymes ou régulateurs.

• Diagnostic moléculaire : prédiction de pathogénicité.

• Compréhension fonctionnelle : mécanismes d’action des mutations.

• Support bioinformatique

  • Couverture
  • Fraction allélique
  • Qualité

• Scores prédictifs: proportionnels à leur impact:

• Scores prédictifs (SIFT, PolyPhen, CADD, dbNSFP)

• Impact VEP Variant Effect Predictor : High, Moderate, Low, Modifier

• Présence dans les bases de données de pathogenicité (ClinVar, HGMD…)

On suit les recommandations ACMG (American College of Medical Genetics).

Annovar est un utilitaire d’annotations de variants. Il fonctionne à partir de génomes divers (hg38, hg19, souris, drosophile, levure, etc…)

Il permet de faire des annotations au niveau des gènes et donc de retrouver les gènes à partir des bases de données RefSeq, Ensembl, etc…

Il permet aussi d’annoter des Régions ainsi que de construire des filtres basés sur le contenu des bases de données.

Les principales bases de données qu’il permet d’utiliser pour l’annotation sont:

(voir https://annovar.openbioinformatics.org/en/latest/user-guide/filter/#summary-of-databases)

• 1000 genomes
• GnomAD
• RefSeq…

• VEP (Variant Effect Predictor) est un outil développé par Ensembl

• Il permet d’annoter automatiquement des variants (SNVs, indels, CNVs…)

• Pour chaque variant, il fournit :

  • Le gène concerné
  • La conséquence biologique (missense, stop gained…)
  • Des effets protéiques, notations HGVS, scores SIFT, PolyPhen

• Supporte les formats VCF, texte tabulé, HGVS

• Exemple: Variant : 13:32316461 C>T

  • Annoté comme missense_variant dans le gène BRCA2
  • Scores : - SIFT : deleterious - PolyPhen : probably damaging
  • Annotation HGVS : NM_000059.4:c.7007G>A (p.Arg2336His)

SnpEff permet de prédire l’effet d’un variant sur les gènes ou protéines (changement dans les acides aminés par exemple).

Référence: Cingolani P et al:, A program for annotating and predicting the effects of single nucleotide polymorphisms, SnpEff: SNPs in the genome of Drosophila melanogaster strain w1118; iso-2; iso-3.”. Fly (Austin). 2012 Apr-Jun;6(2):80-92. PMID: 22728672

Documentation: http://pcingola.github.io/SnpEff/se_introduction/

• Il supporte 38 000+ génomes
• Il supporte le format standard d’annotation ANN
• Notation HGVS (https://varnomen.hgvs.org/bg-material/simple/)
• Support de Sequence Ontology
• Compatible GATK en natif
• Databases: 1000 Genomes Project, GnomAD, COSMIC…

MobiDetails: an interactive application for clinical interpretation of human genome variations Martelotto L.G., Maussion G., Tournier I. et al.* Bioinformatics (2024), btae157

• Application interactive pour explorer, annoter et interpréter les variants génétiques.
• Spécialement conçue pour les laboratoires de diagnostic.
• Intègre des annotations fonctionnelles, des données cliniques et des fréquences populationnelles.

🔗 https://mobidetails.iurc.fr

La base de données Genome Aggregation Database est une base développée à l’intention de la communauté scientifique et médicale pour l’annotation de séquences humaines.

Elle contient les fréquences alléliques de variants strucuraux dans différentes populations pour plus de 76000 génomes (pour hg38) et 10000 génomes (pour hg37) ayant été séquencés dans le cadre d’analyses de maladies rares et de cancers.

Référence: Karczewski, K.J., Francioli, L.C., Tiao, G. et al. The mutational constraint spectrum quantified from variation in 141,456 humans. Nature 581, 434–443 (2020). https://doi.org/10.1038/s41586-020-2308-7

C’est un catalogue de variations génétiques communes (existantes dans au moins 1% de la population) obtenues à partir de donneurs sains, constituant une ressource de référence utilisée par la communauté biomédicale.

Ce catalogue est accessible à travers l’International Genome Sample Ressource.

• Il est continuellement maintenu et mis à jour avec les dernières versions du génome humain et des données provenant de nouvelles populations.

• A ce jour, il contient des variants pour 2504 individus obtenus dans 26 populations.

• Il n’y a aucune donnée phénotypique ou médicales associée.

Référence: A global reference for human genetic variation, The 1000 Genomes Project Consortium, Nature 526, 68-74 (01 October 2015) doi:10.1038/nature15393.

URL: https://cancer.sanger.ac.uk/cosmic Cette base constitue une ressource pour l’exploration de l’impact des mutations somatiques dans les cancers.

Il contient des données traitées manuellement associées à des panels de gènes ciblés. Elles sont disponibles sur les versions hg37 et hg38 du génome humain.

Les données consistent en un catalogue de mutations liées à 1.4 millions de tumeurs obtenues à partir de 26000 publications. Les données sont associées à des meta-données (facteurs environnementaux et historique des patients).

Référence: COSMIC: the Catalogue Of Somatic Mutations In Cancer. John G Tate et al. Nucleic Acids Research, Volume 47, Issue D1, 08 January 2019, Pages D941–D947, https://doi.org/10.1093/nar/gky1015

• SIFT

• Signification : Sorting Intolerant From Tolerant

• Objectif : SIFT prédit si une substitution d’un acide aminé a un effet délétère sur la fonction de la protéine.

• Principe : À partir d’une séquence protéique, SIFT sélectionne des protéines homologues et construit un alignement multiple. Pour chaque position de l’alignement, SIFT calcule la probabilité qu’un acide aminé soit toléré, en supposant que l’acide aminé le plus fréquent est fonctionnel.

Si cette valeur normalisée est inférieure à un seuil, la substitution est prédite comme délétère.

• PolyPhen

  • Signification : Polymorphism Phenotyping
  • Objectif : Prédit l’impact potentiel d’une substitution d’acide aminé sur la structure et la fonction d’une protéine humaine.
  • Méthode : Basée sur des critères physiques (structure 3D) et des comparaisons évolutives.

• CADD

  • Signification : Combined Annotation Dependent Depletion
  • Objectif : Fournit un score intégré reflétant la probabilité qu’un variant soit délétère.
  • Principe :
  1. Combine de multiples annotations fonctionnelles en un seul score.
  2. Compare les variants naturellement sélectionnés avec des mutations simulées pour évaluer leur dangerosité potentielle.

Travailler sur des données de séquençage constitutionnelles (germinales) et somatiques (tumorales) implique des approches et des objectifs très différents, tant sur le plan biologique, bioinformatique, que clinique.

• Varscan utilise en entrée un fichier mpileup qui contient

• La profondeur de lecture par position

• Les bases observées

• La qualité de base (Phred)

• Analyse par VARSCAN: Évaluation des positions présentant une variation :

  • Fréquence allélique
  • Qualité des bases
  • Couverture minimale

• Application de filtres configurables : fréquence, p-value, strand bias…

• Mode Constitutionnel (mpileup2cns) :
  • Appel de variants indépendamment, sans référence au contexte tumoral
  • Résultats : VCF contenant des SNPs et indels germinaux
• Mode Somatique (somatic) :
  • Comparaison normal vs tumeur à chaque position
  • Identification des variants somatiques via :
  1. Analyse différentielle des fréquences (Comparaison des fréquences alléliques sain et tumoral)
  2. Tests statistiques (Fisher exact test)

• Filtrer sur la fréquence allélique maximum observable dans la population générale (**pathogénique = rare dans la population)

• Filtrer sur l’impact mesuré par SIFT ou PolyPhen

• Contrôle Qualité (FASTQC)
• Trimming des séquences adaptatrices (Triommomatic)
• Alignement sur le génome de référence (BWA)
• Détection des mutations (Varscan)
• Annotation des variants (SnpEff)
• Visualisation des données (Read, SNPs) (IGV - Integrative Genomics Viewer)

• Fichiers de séquences brutes: .fastq (Compressé: .fastq.gz)
• Fichiers de séquences alignées .BAM
• Index de fichiers de séquences alignées .BAI
• Génome complet au format FASTA: .fa ou .fasta.
• Fichiers listant les mutations/Indels: .vcf.

Merci à Nicole CHARRIERE (Admin IFB) pour avoir créé l’espace de travail de cette formation sur l’infrastructure IFB